D-荧光素钾盐; D-虫荧光素钾盐

哺乳动物发光，一般是将萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase）基因整合到需观察细胞的染色体 DNA 上，以表达荧光素酶，培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株，当细胞分裂、转移、分化时，荧光素酶也会得到持续稳定的表达。标记后的荧光素酶只有在活细胞内才会产生发光现象，并且发光强度与标记细胞的数目呈线性相关。除萤火虫荧光素酶外，有时也会用到海肾荧光素酶（Renilla Luciferase）。二者的底物不同，萤火虫荧光素酶的底物是荧光素（Luciferin，常见钾盐或者钠盐）。二者的发光波长也不一样，前者发光波长在 540-600nm，后者发光波长在 460-540nm。荧光素所发的光更容易透过组织，在体内代谢较慢，而且特异性好，由于没有背景干扰，因此可以很容易检测出低至0.02pg水平的荧光素酶。所以大部分活体成像实验采用萤火虫荧光素酶基因作为报告基因。

D-荧光素（D-Luciferin）是荧光素酶（Luciferase）的常用底物，普遍应用于整个生物技术领域，特别是体内活体成像技术。其作用机制是在 ATP 和荧光素酶的作用下，荧光素（底物）能够被氧化产生蓝绿色的光 (560nm)。当荧光素过量时，产生的光量子数与荧光素酶的浓度呈正相关性（见下图）。将携带荧光素酶编码基因（Luc）的质粒转染入细胞后，导入研究动物如大、小鼠体内，之后注入荧光素，通过生物发光成像技术（BLI）来检测光强度变化，从而实时监测疾病发展状态或药物的治疗功效等。也可以利用 ATP 对此反应体系的影响，根据生物发光强度的变化来指示能量或生命体征。

D-荧光素也常用于体外研究，包括荧光素酶和 ATP 水平分析、报告基因分析、高通量测序和污染物检测。目前有三种产品形式：D-荧光素（游离酸），D-荧光素盐（钠盐和钾盐）。主要差别在于溶解特性：前者的水溶性以及缓冲体系的溶解性都较弱，可溶于甲醇和 DMSO；后者能够易溶于水或缓冲液中，使用方便，溶剂无毒性，特别适合体内实验。配成溶液后的这三种产品，在绝大多数的应用上都没有实质性的差别。根据文献及客户使用习惯，目前使用D-荧光素钾盐的较为常见。荧光素钾盐和荧光素钠盐应用上没有差别，两者的差别在于物理性状上如外形和溶解性。钠盐的水溶性高于钾盐。从目前发表的文献来看，钾盐的使用率远高于钠盐，尤其是体内实验。两者功效相同。

Purescix自主研发的D-荧光素钾盐具有纯度高、溶解性好、发光强度高、衰减慢等特点，媲美进口产品。目前已经实现批量化生产，批产量高达公斤级。

体外实验：溶解性(25°C)：水：30 mg/ml

*请参考溶解度信息来选择合适的溶剂配制储备液。配成溶液后，请分装保存，避免反复冻融。

*Purescix内部测试了所有化合物的溶解度，若实际溶解度与公布的值略有不同为正常现象，是由于批次之间的轻微差异造成的，请适当调整之后使用。

体内实验(现用现配)：用1mL无菌 D-PBS（w/o Ca2+,Mg2+）或PBS，溶解15mg D-荧光素钾盐

                                    此方案可获得15mg/mL的澄清溶液

*以上溶解方案仅供参考，您根据实验动物和给药方式进行适当的调整。

*体内实验的工作液，建议现用现配，当天使用。

*如果在配制过程中出现沉淀、析出现象，可以通过加热和/或超声的方式助溶。

体外—生物发光试验：

（1）材料：D-荧光素钾盐（美仑货号MB1834）、无菌纯水（美仑货号 MA0028）、完全培养基（自行配制）

（2）步骤：

① 用无菌水制备 100× D-荧光素钾储备液（15mg/ml），轻轻颠倒摇动至荧光素完全溶解，0.22μm滤膜过滤除菌。立即使用或分装后-20℃冻存。

② 将D-荧光素钾储备液溶解于预热好的组织培养基中，制备成浓度为 150μg/ml 的工作液。用组织培养基 1∶100 稀释储存液，配制工作液（终浓度150μg/ml ）。

③ 去除培养细胞的培养基。

④ 图像分析前，向细胞培养板中添加 1×荧光素工作液，然后进行图像分析。

提示：成像前在 37℃下对细胞进行短时间孵育可增强信号。

体外—基因检测实验：

（1）材料：D-荧光素钾盐（美仑货号MB1834）、无菌纯水（美仑货号 MA0028）、25 mM tricine缓冲液 (pH 7.8) 、ATP、DTT、MgSO4、细胞裂解液

（2）步骤：

① 用无菌水制备100 mM D-荧光素钾储备液，立即使用，或分装后于-20℃下储存，避免反复冻融，避光。

② 在25 mM tricine缓冲液 (pH 7.8) 中制备含有3 mM ATP、1 mM DTT和15 mM MgSO4的1 mM D-荧光素钾工作液。

③ 将5-10 μL 细胞裂解物转移到孔板中。使用不含裂解物的裂解试剂或缓冲液作为空白对照。

④ 立即注入 200 μL D-荧光素钾工作液，结合时间为10秒。

体内—活体成像分析：

（1）材料：D-荧光素钾盐（美仑货号MB1834）、D-PBS（不含钙镁，美仑货号 MA0010）或PBS（美仑货号MA0015）

（2）配制溶液：

使用无菌 D-PBS（w/o Ca2+,Mg2+）或PBS配制 D-荧光素钾溶液（15mg/ml）， 0.22µm 滤膜过滤除菌（避光），分装后于-20℃或-80℃冷冻保存，避免反复冻融。使用时 4℃融化，实验前平衡至室温（避光）。

（3）注射量取决于注射方式，具体如下：

（4）注射入体内 10-20 min（待光信号达到最强稳定平台期），再进行成像分析。

注意： 建议对每只动物模型都建立荧光素酶动力学曲线，从而确定最高信号检测时间和信号平台期。保存和操作的过程中都要避光。另外水溶性储存液过滤除菌后，可以-20℃或-80℃分装冻存，避免反复冻融。

如果有条件，对储存液充氮气或氩气（防止氧化），稳定性和保存时间更长。注射方式、动物类型以及体重等都会影响信号的发射，因此建议每次实验都要做荧光素酶动力学曲线，确定最佳信号平台期和最佳的检测时间。

1. 我司产品为非无菌包装，若用于细胞培养，请提前做预处理（如0.22μm滤膜过滤），除去热原细菌，否则会导致染菌。

2. 溶解性是在室温下测定的，如果温度过低，可能会影响其溶解性。

3. 科研试剂，严禁用于人体和临床。

4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

5. 部分产品我司仅能提供部分信息，我司不保证所提供信息的权威性，以上数据仅供参考交流研究之用。

[1]. Giuseppe Meroni, et al. D-Luciferin, derivatives and analogues: synthesis and in vitro/in vivo luciferase-catalyzed bioluminescent activity. ARKIVOC 2009 (i) 265-288.

[2]. Rajesh Shinde, et al. Luciferin derivatives for enhanced in vitro and in vivo bioluminescence assays. Biochemistry. 2006 Sep 19;45(37):11103-12.

[3]. Inoue Y, et al. Timing of imaging after d-luciferin injection affects the longitudinal assessment of tumor growthusing in vivo bioluminescence imaging. Int J Biomed Imaging. 2010;2010:471408.